Der legendäre Superheld (Tobey Maguire) trifft auf seinen neuen Gegenspieler – den ebenso genialen wie teuflischen „Doc Ock“ (Alfred Molina), der mit vier mächtigen Tentakeln ausgestattet ist. Mary Jane (Kirsten Dunst) hat mittlerweile eine Karriere als Schauspielerin begonnen und einen neuen Mann an ihrer Seite. Sehr zum Missfallen von Peter, der immer noch gegen den ständigen Impuls ankämpfen muss, sein Doppelleben aufzugeben und Mary Jane endlich seine Liebe zu gestehen. Doch damit nicht genug: Auch Peters Verhältnis zu seinem besten Freund Harry Osborn (James Franco) wird überschattet durch dessen abgrundtiefen Hass auf Spider-Man, den er für den Tod seines Vaters verantwortlich macht.